Dipyridamole 42

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Dipiridamolo inibisce in modo reversibile Mengovirus RNA replica RIASSUNTO dipiridamolo è un efficace inibitore della crescita cardiovirus in coltura cellulare. Gli effetti del dipiridamolo sulla replicazione mengovirus in vivo e in vitro sono stati esaminati nella speranza il farmaco potrebbe essere usato come un analogo sperimentale della guanidina inibitore poliovirus. Guanidine inibisce selettivamente poliovirus RNA traduzione sintesi, ma non di RNA, e come tale, è stato un valido strumento di ricerca. Anche se guanidina non inibisce l'infezione cardiovirus, un composto con caratteristiche simili discriminatorie sarebbe sperimentalmente utile per il lavoro parallelo con questi virus. Abbiamo scoperto che la formazione della placca mengovirus in HeLa o cellule L veniva inibita quasi 100 dalla presenza di 80 M dipiridamolo. L'effetto inibitorio era reversibile e mirato un primo passo nel ciclo di replicazione. Studi con mengovirus repliconi luciferasi che esprimono hanno dimostrato che la sintesi delle proteine ​​virali non è stata influenzata da dipiridamolo, e piuttosto, la sintesi di RNA è stato il passo di mira dalla droga. Questa valutazione è stata confermata da analisi dirette di traduzione virale e attività di sintesi di RNA in un Krebs-2-derivato in vitro sistema che ha sostenuto completa, replica cardiovirus infettiva. In Krebs estrae, dipiridamolo specificamente inibito sintesi di RNA virale a più di 95, senza alcun effetto concomitante sulla traduzione proteina virale o la trasformazione poliproteico. L'inibizione osservato reversibilmente colpito un primo passo in entrambe le minus-strand e plus-filamento sintesi di RNA, anche se l'inibizione della sintesi più filamento è stata più profonda di quella della sintesi minus-filamento. Concludiamo che il dipiridamolo è un potente strumento sperimentale che distingue facilmente tra traduzione cardiovirus e funzioni di replica di RNA. L'RNA genomi positivo-senso di tutti i membri della famiglia hanno Picornaviridae 5 regioni non tradotte, seguita da singoli, cornici lunga lettura aperta, 3 regioni non tradotte, e poli code (A). Traduzione del reading frame è diretto da un sito di inserimento ribosomiale interno, situato all'interno della regione non tradotta 5 (14). Le conseguenti poliproteico subiscono una progressione di cis e trans fratture proteolitici, generando una cascata di intermedi poliproteici e singoli, proteine ​​mature. Le proteine ​​regione P1 (1A, 1B, 1C, 1D e) diventano le unità strutturali per i nuovi virioni. La P2 (2A, 2B, 2C e) e P3 (3A, 3B VPG. 3C pro. E pol 3D) proteine ​​sono non strutturale. Durante l'infezione, P2 e P3 regione precursori e proteine ​​mature interagiscono tra loro, con le proteine ​​cellulari, e con particolari elementi - acting genoma cis per dirigere la sintesi di nuovo RNA virale. Gran parte della nostra attuale comprensione dei processi coinvolti nella replicazione picornavirus RNA si basa su studi con poliovirus (recensione in riferimento 23). Tra i passaggi descritti sono una serie discreta di interazioni proteina-RNA che aiutano a regolare la conversione genoma dalla traduzione ai modelli di replica. Ad esempio, poli cellulare (C) - di legame proteina virale e 3CD polimerasi precursore sono noti per associare un RNA motivo quadrifoglio in prossimità del 5 fine del genoma poliovirus (9. 10. 13. 21). In combinazione con poli cellulare (A) binding PABP1 proteine, che collega la regione non tradotta 3, il complesso intatto aiuta presumibilmente circularize il genoma e orientare la polimerasi virale (Pol 3D) per l'iniziazione meno-filo (13). Tra gli altri passaggi obbligati, proteina virale VPG (3B) è uridylylated dal pol 3D per formare VPG-pupu, nelle reazioni templated da un cis interne - acting elemento replication (cre), che, di nuovo, è parte del genoma di RNA (16. 28. 37). Recenti studi suggeriscono inoltre che VPG uridylylation può non essere strettamente necessario per l'inizio della sintesi minus-filamento, ma piuttosto, non modificato VPG possono agire direttamente con la regione non tradotta 3 (19. 20). Indipendentemente da ciò, una volta full-length fili meno sono stati sintetizzati, è generalmente accettato che per poliovirus, nuovo RNA iniziazione plus-strand richiede l'uridylylation di VPG, o VPG contenenti precursori, utilizzando il cre interno come modello. RNA allungamento dopo i risultati di reazione VPG-innescato in nuove, full-length, plus-strand molecole. Più o reiterativi iniziazioni polimerasi sugli stessi modelli meno filamento producono, ramificate strutture intermedie replicative distintivi. I nuovi settori e le vengono rilasciate dal complesso e servono come mRNA per la traduzione delle proteine ​​più virali, come modelli per ulteriori cicli di replicazione del genoma, o come RNA virione encapsidated in particelle progenie maturi. Elegante come questo modello è, molte delle caratteristiche proposte per il ciclo di replica poliovirus (enterovirus), non hanno omologhi evidenti o analoghi tra altri generi di picornavirus. Aphthoviruses, cardioviruses, kobuviruses, teschoviruses e hepatoviruses, per esempio, mancano 5 motivi quadrifoglio. Hanno diversi 3 sequenze della regione non tradotte, e le loro strutture CRE presunti sono distribuiti in vari locali in ogni genoma diverso. I modelli di elaborazione poliproteina sono unici per ogni tipo di virus, compresi VPG e dei suoi precursori osservati. La capacità di prendere in giro a parte le caratteristiche essenziali di questi schemi di replica in parallelo è stato ostacolato in qualche modo dalla mancanza di strumenti molecolari comuni che hanno dimostrato essenziale per i sistemi di poliovirus. In particolare, l'antivirale agente guanidina-HCl è ampiamente riconosciuto come un potente inibitore della replicazione poliovirus ed è creativamente impiegate in molti esperimenti di poliovirus-based. Guanidine impedisce in modo specifico l'inizio della sintesi di RNA meno filamento (3), consentendo in tal modo una facile separazione sperimentale di funzioni di traduzione di RNA di poliovirus dalle funzioni di sintesi di RNA. Inoltre, poiché l'azione di guanidina è reversibile, ritiro farmaco può avviare avvio sincrono di replicazione RNA per esperimenti in vitro. resistenza Guanidine in poliovirus è associata con mutazioni nucleotidiche nel gene 2C della regione P2, e il farmaco inibisce l'attività di ATPasi 2C poliovirus ricombinante (2. 25. 26). Purtroppo, guanidina non ha attività equivalenti contro la maggior parte delle altre picornavirus, tra cui cardioviruses (15. 27). Questa specificità è sconcertante perché il 2C e proteine ​​3D pol condividono sequenza definitiva e analogie meccanicistiche tra tutti i membri della famiglia. Come una sonda iniziale in i fondamenti del sistema di replica specifici mengovirus, abbiamo impiegato un sistema di replica cell-free base di Krebs-2 estratti cellulari, simile a quella recentemente descritta da Yuri Svitkin (32). Simile a sistemi basati su celle HeLa per de novo replica poliovirus (17), Krebs-2 estratti supportano tutte le funzioni necessarie per la sintesi infettiva cardiovirus, compresa la traduzione della proteina sito-entry ribosoma, poliproteina trasformazione, la replicazione RNA virale, e la formazione di virioni (32). La natura privo di cellule delle reazioni consente l'accesso sperimentale diretto ad ogni percorso biochimico. In assenza di membrane cellulari, droga o dell'anticorpo aggiunte sono anche liberamente manipolati. Ora riportiamo utilizzo del sistema di Krebs-2 per caratterizzare l'attività antivirale del dipiridamolo, uno dei pochi farmaci noti per influenzare la crescita cardiovirus in coltura tissutale. Dipiridamolo è una purina modificato con applicazioni terapeutiche commercialmente come agente antiaggregante (8). E 'anche un potente inibitore di infettività mengovirus a FL e cellule L (35). Abbiamo rintracciato la fonte di questa inibizione ad un passo molecolare reversibili nelle prime fasi del percorso di replica mengovirus RNA. Dipiridamolo non ha influenzato traduzione o poliproteico elaborazione interna di entrata ribosoma sito-dipendente in vitro o in vivo, e, al riguardo, si comportava come guanidina nei sistemi di replica poliovirus. Dipiridamolo è chiaramente un potente pratico nuovo reagente, che dovrebbe essere estremamente utile nei successivi esperimenti per confrontare e contrapporre gli eventi specifici in sintesi di RNA cardiovirus con quelli provenienti da altri picornavirus. MATERIALI E METODI Virus e cellule. cellule HeLa-H1 (ATCC CRL1958) sono state coltivate in colture in sospensione con medie Eagles modificata e 10 siero di vitello. topo cellule L929 sono state coltivate in terreno RPMI supplementato con 10 siero fetale di vitello. Ricombinante mengovirus vMwt (6) propagazione in cellule HeLa e titolazione virale mediante saggio di placca erano come descritto (29). In saggi di inibizione dipiridamolo, i monostrati cellulari (3 10 6 cellule) sono stati esposti al virus (200 PFU), per 30 min a 20 C. Gli inoculi sono stati rimossi e le cellule sono state ricoperte con agar (1), seguito da un mezzo liquido overlay contenente dipiridamolo (0 a 80 M, Sigma) solubilizzati in etanolo. Dopo 30 ore di incubazione (37 ° C sotto i 5 CO 2) le cellule sono state colorate con cristalvioletto di visualizzare placche. efficienza Drug (inibizione percentuale) è stato definito come il rapporto di placche formate su trattati contro cellule non trattate. test di reversibilità della droga e tempi erano simili, tranne che l'infezione era con 50 PFU / cellula (3 10 6 celle). la sovrapposizione mezzo liquido è stato sostituito come indicato con terreno fresco (con o senza 80 M dipiridamolo), ei campioni sono stati raccolti dopo 8 ore di incubazione (37C, sotto 5 CO 2). Le cellule sono state sottoposte a tre cicli di congelamento-scongelamento ei surnatanti sono stati poi chiarite titolati per infettività mediante saggio di placca. Ribozima cDNA. Il replicone mengovirus pMluz è stato descritto (7). Esso codifica un gene luciferasi di lucciola (luc) che sostituisce una porzione della regione capside codifica virale nel contesto del plasmide mengovirus PMWT. trascrizioni polimerasi T7 su modelli da pMluz iniziano con due 5 residui G non virali, prima che il virale genoma / giornalista, e finiscono sul lato 3, con un poli (A) 23 - CG sequenza (7). Per creare plasmidi che esprimono trascritti virali senza le esogeni 5 basi, un ribozima cassetta auto-scissione (4. 12) è stato costruito dalla sovrapposizione primer cDNA e quindi progettato in pMluz. Primers P1 a P8 (Tabella 1) sono stati fatti reagire con T7 polinucleotide chinasi (Promega). coppie complementari, P1P2, P3P4, e P7P8, sono stati combinati, denaturato (95C), e ha permesso di ibridare. I frammenti di prodotto (tre coppie) sono stati mescolati, trattati con T4 DNA ligasi (Promega), e poi digeriti con RsrII e NdeI (New England Biolabs), la creazione di un frammento ribozima-codifica che potrebbe essere sostituito per il frammento analogo a pMluz. Dopo la trasformazione in Escherichia coli MVII90, plasmide Rz-pMluz è stato amplificato e quindi schermato da sequenziamento in tutte le regioni di interesse (promotore T7, ribozyme, 5 fine del genoma mengovirus). Plasmidi Rz-pMluz, con una mutazione puntiforme inattivando la sequenza ribozima (evidenziato basi in tabella 1), è stato di progettazione identiche tranne fondo coppia P5P6 sostituito P3P4 durante la costruzione. I plasmidi Rz-PMWT e Rz-PMWT erano simili tranne che collegati, rispettivamente, la wild-type (Rz) e mutanti sequenze (Rz) ribozima ad un intatto, infettiva sequenza PMWT genoma. saggi Replicon. Plasmidi pMluz, Rz-pMluz, e Rz-pMluz sono stati digeriti con BamHI prima reazione di trascrizione con T7 RNA polimerasi. Gli RNA prodotti sono stati estratti con fenolo-cloroformio e poi precipitato con etanolo. Dopo risospensione in acqua, la concentrazione di RNA è stata determinata mediante assorbanza a 260 nm. monostrati di cellule confluenti HeLa (1.7 10 6 cellule per piastra da 35 mm) sono state incubate (30 min, 20C) con RNA (1 g) e liposomi. Le piastre sono state lavate e poi sovrapposti con manutenzione terreno contenente dipiridamolo (0 a 80 M). Dopo incubazione (37C sotto 5 CO 2), le piastre sono state lavate con PBS e le cellule sono state lisate con il reagente di lisi luciferasi (Promega). l'attività luciferasi è stata determinata in saggi standard (luciferasi sistema di dosaggio, Promega) utilizzando un luminometro Monolight del 2010. Isolamento di Krebs-2 lisati S10. Krebs-2 propagazione cellule ascite in topi e l'isolamento di lisati S10 erano come descritto (32). In breve, inoculi di cellule Krebs-2 (0,4 ml), gentilmente forniti da Yuri Svitkin della McGill University, sono state iniettate nelle cavità peritoneale di topi (6 settimane di vita, di sesso femminile, BALB / c). Dopo 7 giorni, i topi sono stati sacrificati, i fluidi ascite sono state raccolte e poi trasferite in Earls soluzione salina bilanciata su ghiaccio. Dopo due lavaggi con soluzione salina bilanciata Earls, le cellule pellet sono stati sospesi in Dulbeccos modificato Eagles mezzo senza metionina e incubate con lieve agitazione (2 h, 37 ° C). La sospensione è stata filtrata attraverso una garza per rimuovere il particolato, e poi le cellule sono state raccolte per centrifugazione e lavato due volte con tampone HNG (35 mM HEPES-KOH, pH 7.3, 146 mM NaCl, 11 mM d-glucosio). pellet cellulari sono stati risospesi in tampone ipotonico (25 mM HEPES-KOH, pH 7,3, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl 2) e posti su ghiaccio (20 min). Le cellule sono state rotte da Dounce omogeneizzazione (15 colpi) e poi integrato con 1/10 ° volume di tampone concentrato (25 mM HEPES-KOH, pH 7,3, 1 M KCH 3 COO, 30 mM MgCl 2. 30 mM ditiotreitolo). Dopo centrifugazione (10.000 g), aliquote dei surnatanti (frazione S10) sono stati Flash congelati in ghiaccio secco prima di stoccaggio (80C). La sintesi delle proteine, la sintesi di RNA, e VPG uridylylation in Krebs-2 lisati S10. RNA virale (vMwt) è stato isolato da virioni saccarosio purificato (29). Le particelle sono stati interrotti con sodio dodecil solfato (SDS, 1) e proteinasi K (20 g / ml), seguita da estrazione con fenolo-cloroformio e precipitazione con etanolo. trascritti virali ricombinanti sono state preparate come descritto per i saggi replicone. Traduzione Cardioviral e replicazione in Krebs-2 lisati programmati con questi RNA erano essenzialmente come descritto (32). I lisati (200 l) sono stati trattati con nucleasi micrococcica (150 unità / ml) in presenza di CaCl 2 (75 mM, 20C, 20 min) prima EGTA stato aggiunto (2 mM), per spegnere la nucleasi. Proteine ​​/ reazioni di sintesi di RNA contenevano lisato nucleasi-trattati (20 l, o 50 in volume), i nucleotidi (1 mM ATP, 0.2 mM GTP, 0,2 mM CTP, 0,2 mM UTP), creatina fosfato (10 mm), la creatina chinasi (0.2 mg / ml), l ammino acidi (0,2 mM ciascuno, senza metionina), tampone di sale (75 mM KCH 3 CO 2. 1 mM MgCl 2. 0,25 mM spermidina), e sia RNA virione (0,5 g) o RNA trascritto ( 1 g). Quando è stato richiesto l'etichetta di proteine, il mix è stato integrato con il 35 Smethionine (2 l, 10 Ci / l Amersham), e l'incubazione era per 3 ore (32C), dopo di che tampone (8 l, con 1 SDS) Laemmli carico è stato aggiunto. bande proteiche sono state visualizzate dopo pagina frazionamento e autoradiografia. Quando è stato richiesto l'etichetta RNA, 32 PCTP (1,5 l, 10 Ci / l, Perkin Elmer) dopo 3,5 h di incubazione a 32 ° C. Un'ora più tardi, complessi di replicazione sono state raccolte mediante centrifugazione (16.000 g per 15 minuti). I pellet sono stati risospesi in tampone 1x Tricine e analizzati mediante frazionamento su (12) gel Tris-Tricine-poliacrilammide. Le bande etichettati sono state visualizzate mediante autoradiografia e quantificate da phosphorimaging. Ricombinante pol 3D. mengovirus ricombinanti 3D pol è stato espresso e isolato utilizzando procedure simili a quelle per poliovirus (11). Craig Cameron, Penn State University, ha fornito generosamente plasmide pM3D che codifica per una proteina di fusione 3D pol mengovirus ubiquitina-linked. induzione della proteina dopo pM3D trasformazione di E. coli BL21 (pCG1) (fornita anche da Cameron) si traduce in scissione della porzione ubiquitina e l'accumulo di pol 3D. Le cellule trasformate sono state coltivate in brodo YT 2 addizionato con cloramfenicolo e kanamicina a 37C (A 600 di 0,1). Isopropylthiogalactopyranoside (IPTG) è stato aggiunto (a 500 M) ed è stato continuato incubazione (3,5 h). Le cellule sono state raccolte per centrifugazione, lavate due volte con tampone TE (10 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM EDTA), prima di risospensione (a 4 mg / ml) in tampone di lisi (100 mM KPO 4. 60 M ZnCl 2. 4 g / ml leupeptina, 10 mM ditiotreitolo e 2 mM phenylmethylsulfonyl fluoro). Lisi era mediante ultrasuoni (quattro volte per 30 secondi ciascuno). Polyethyleneime (5, 0,0534 l / ml lisato cellulare) è stata aggiunta e detriti cellulari è stato separato mediante centrifugazione (100.000 g. 30 min a 4 ° C). Solfato di ammonio è stato aggiunto (314 g / litro) e la proteina insolubile è stato raccolto per centrifugazione (12000 g. 30 min, 4C). Il pellet è stato risospeso (50 mM Tris-HCl, pH 8,0), dializzato contro tampone C (da 12 a 14 h, 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 20 glicerolo, 60 M ZnCl 2. 0.1 NP-40, 50 mM NaCl ) e poi applicato ad una colonna Cibacron blu (5 ml, Bio-Rad) che era stata equilibrata in tampone C. eluizione era con un gradiente di NaCl (da 50 a 1000 mm). Le frazioni contenenti pol 3D. come osservato mediante gel elettroforesi, sono state riunite e caricate su una colonna Q-Sepharose (5 ml, Bio-Rad). Un gradiente lineare di NaCl (50 a 200 mM) è stata applicata. Le frazioni contenenti pol 3D sono riunite, riapplicata ad una colonna di Q-Sepharose fresco (0,5 ml, Bio-Rad), e poi eluite con tampone (50 mM HEPES-KOH, pH 8.0, 20 glicerolo, 60 M ZnCl 2 10 mM. - mercaptoetanolo, 0,1 NP-40, 500 mM NaCl). L'enzima ricombinante è stato testato in reazioni (50 l) contenenti proteine ​​3D pol (1 g), oligo Primer (G) (25 g), poli template (C) (5 g), 32 PGTP (1 l, 10 Ci / l , 3000 Ci / mmol, Amersham) e tampone (50 mM HEPES-KOH, pH 7.5, 10 mM - mercaptoetanolo, 5 mM MnCl 2. 60 M ZnCl 2. 0.5 mM GTP). I campioni sono stati incubati per 30 min (30C) prima dell'aggiunta di EDTA (4 mM). L'incorporazione di acido insolubile di etichetta è stata determinata (duplicate 5-l aliquote) mediante test del filtro. RISULTATI Dipyridamole colpisce mengovirus placche. infezione Mengovirus di confluenti HeLa o monostrati cellulari L produce placche di circa 2 mm di diametro, dopo 30 ore di incubazione. Per entrambi i tipi di cellule, la presenza di dipiridamolo ridotto significativamente il numero di placche e le dimensioni della placca in modo dose-dipendente (Tabella 2). Sebbene farmaco solubilità limitata alla dose massima testata a 80 M, a questo livello non placche erano evidenti in cellule HeLa anche dopo 72 h (non mostrato), e le poche che formato in cellule L erano minute dimensioni e difficile da rilevare. Le cellule trattate con solo dipiridamolo erano indistinguibili da cellule non trattate come determinato al microscopio ottico standard (dati non mostrati). Mengovirus fenotipi placca in presenza di inibizione dipiridamolo placca è reversibile. Per determinare se l'inibizione dipiridamolo era reversibile, il farmaco è stato rimosso da culture infetti in vari momenti postinfection mediante scambio con terreno privo di droghe (Fig. 1A). Quando le cellule HeLa sono stati liberati dalla droga a 1 h postinfection, il virus ha recuperato 7 h dopo titolati quasi alto come controlli libera dalla droga. L'esposizione al farmaco per tempi più lunghi progressivamente abbandonato i titoli apparenti fino al 10 4 fold se i campioni sono stati analizzati a 8 ore postinfection. Tuttavia, se il farmaco è stato rimosso tra 2 e 6 ore postinfection, ei campioni sono stati autorizzati a recuperare per un pieno 7 a 8 h, la produzione di virus tipicamente recuperato a livelli di astinenza quasi (non mostrato). Ad esempio, se il farmaco è stato rimosso a 2 h postinfection, il virus recuperato al 9 postinfection titolato al 9.2 10 8 PFU / ml. Quando il farmaco è stato rimosso a 6 ore postinfection, il titolo ha raggiunto 5.1 10 8 pfu / ml per 13 h postinfection. Considerando questi esperimenti sono stati avviati al 50 PFU per cellula, i risultati confermano fortemente rapporti precedenti che il dipiridamolo è un potente inibitore della crescita mengovirus (35). Inoltre, essi indicano l'effetto della droga era reversibile se l'infezione è stato permesso il tempo sufficiente per recuperare. Dipiridamolo e la resa dei virus. monostrati di cellule HeLa sono state infettate ad una molteplicità di 50 PFU / cellula. campioni dipiridamolo trattati (DPM) aveva 80 M dipiridamolo (in etanolo) aggiunti al mezzo al momento dell'infezione. campioni dipiridamolo-greggia (DPM) sono stati trattati con un equivalente volume di etanolo. (A) Media da culture dipiridamolo-trattato è stato scambiato con terreno privo di droga ai tempi indicati. Virus è stato raccolto in 8 h postinfection e il titolo è stato determinato mediante saggio di placca. (B) Medium da culture dipiridamolo-non trattati è stato scambiato con terreno contenente dipiridamolo (80 M) ai tempi indicati. Virus è stato raccolto a 8 ore postinfection e poi titolati. L'esperimento inverso di aggiunta del farmaco a seguito progressivamente i tempi dopo l'infezione avviati rivelato che l'attività di farmaco mirato un primo passo nel ciclo di replicazione virale (Fig. 1B). Il dipiridamolo era più assente dal mezzo, maggiore è il titolo del virus recuperati. Una volta che l'infezione proceduto ultimi 3 a 4 ore, il dipiridamolo è diventato meno efficace a inibire processi virali. Drug aggiunto dopo 6 h postinfection era quasi inefficace su campioni titolato al 8 h postinfection. sono stati osservati risultati simili per le cellule L mengovirus infettate (non mostrati). repliconi Mengovirus. difetti farmaco-indotta sulla traduzione di RNA di ingresso o sulla inizio della sintesi di RNA sarebbe manifestato in modo equivalente nei test precedenti, già bloccato fasi del ciclo di replicazione virale. Abbiamo precedentemente riportato alla corretta applicazione di un replicone mengovirus in cui un gene reporter luciferasi (luc) ha sostituito parte della regione capside-codifica. Questo sistema è stato utilizzato per prendere in giro a parte i contributi di traduzione del genoma e la sintesi di RNA sul ciclo di crescita cardioviral (7). La trasfezione di pMluz RNA in cellule HeLa dà una risposta bifasica luciferasi (ad esempio Fig. 2A) come proteina viene prima tradotto da trascrizioni di ingresso (da 1 a 3 h), e poi da RNA virale replicati (da 3 a 8 h). Un recente lavoro con repliconi simili da poliovirus, però, ha chiamato questa interpretazione in discussione. Per poliovirus, la presenza di due residui 5 guanosina non virali, i manufatti ingegnerizzati di reazioni polimerasi T7, ha dimostrato di influenzare la risposta bifasica luciferasi di repliconi poliovirus. trascrizioni Replicon alternativi su misura con precisi virali 5 estremità, attraverso l'uso plasmidica sequenze ribozima, sono stati trovati per avviare la replica, a volte precedenti, e il ritardo tra traduzione di RNA di ingresso e la traduzione nuovo RNA è stato relativamente diminuita (12). Prima di testare dipiridamolo con mengovirus repliconi, è sembrato prudente indagare in primo luogo se la trascrizione 5 estremità sarebbero allo stesso modo influenzare i saggi analoghi con le sequenze cardiovirus. saggi Replicon. (A) monostrati di cellule HeLa sono state trasfettate con l'RNA trascritto da plasmidi Replicon mengovirus o finto trasfettate (finto). Al tempo posttransfection indicato, le cellule sono state raccolte e lisate e l'attività della luciferasi nel citoplasma è stata determinata. unità di luce relative (RLU) sono i valori per duplicato (20 l) campioni media. (B) I campioni sono stati trattati come in A, eccetto che dipiridamolo (80 M in etanolo) è stato aggiunto al mezzo di una serie di campioni Rz-pMluz al momento della transfezione. I campioni di controllo avevano volumi equivalenti di etanolo aggiunti al mezzo. Di conseguenza, attivi (Rz-pMluz) e inattivi (Rz-pMluz) cassette ribozima sono stati incorporati in plasmidi pMluz. Gli RNA risultanti avevano 0 o 50 non virali 5 basi, rispetto alle due basi non virali (GG) alla fine del 5 pMluz. Quando la prova nelle cellule, e in contrasto con i rapporti di poliovirus (12), tutte le trascrizioni mengovirus replicazione-competente mostravano ancora la produzione di luciferasi bifasico (Fig. 2A) che discriminato input da traduzione RNA replicato. La fase di latenza iniziale per Rz-pMluz conclusa a circa 3 ore postinfection, più o meno lo stesso tempo come il ritardo visualizzato dagli altri trascritti replicano contenenti nucleotidi non virali. Pertanto, la presenza di un autentico virale 5 finale non ha alterato la fase di latenza, come è stato riportato per poliovirus (12). Come poliovirus, tuttavia, mengovirus RNA con precise estremità virali (Rz-pMluz) divenne poi 5- a 10 volte più efficace modelli di replica rispetto a quelli con due (pMluz) o 50 (Rz-pMluz) basi eterologhi. I campioni di controllo con polimerasi difettosi (pMluz-Età) non è riuscito a convertire il RNA traducono in modelli di replica, a prescindere dal tempo di incubazione. Come previsto, bassi livelli di luciferasi continuato ad essere sintetizzato da tali trascrizioni, fino a che, presumibilmente, degradati (6 h). Il mengovirus ribozima replicone altamente attivo è stato successivamente testato per la sensibilità dipiridamolo (Fig. 2B). Inizialmente, luciferasi è stato prodotto dalla RNA di ingresso a livelli simili a campioni non trattati con farmaci, suggerendo che la traduzione iniziale genoma non è stato il passo colpiti dalla droga. Chiaramente, però, il dipiridamolo ha impedito la fase successiva, la replica-dipendente della sintesi proteica, e la curva di droga essenzialmente parallelo che di campioni di controllo programmati con polimerasi inattivo (PMWT-Age). Krebs-2 test con RNA virione. Nel 2003, Svitkin e Sonnenberg (32) hanno descritto un efficace sistema di lisato Krebs-2 che ha permesso l'esame in vitro di tutte le fasi del ciclo di replicazione del virus dell'encefalomiocardite. Con la consulenza e reagenti generosamente fornito da Y. Svitkin, abbiamo riprodotto questo sistema, e stabilito che quando programmato con l'RNA mengovirion o trascrizioni Rz-PMWT, Krebs-2 lisati sintetizzati almeno 10 8 pfu / ml di infettive progenie mengovirus entro 20 h (non mostrato). Una caratteristica fondamentale di qualsiasi test cell-free è che i prodotti di traduzione e di replicazione virale possono essere facilmente etichettati e monitorati. L'aggiunta di 35 Smethionine agli estratti programmato con RNA mengovirus virione ha dato il pannello completo dei precursori virali attesi e prodotti di dissociazione (Fig. 3. corsia 2). L'aggiunta di 80 M dipiridamolo o del suo solvente, l'etanolo, non ha modificato questo modello in modo significativo (Fig. 3. corsie 3 e 4). Ma, quando RNA sintesi è stata monitorata mediante l'aggiunta di 32 PCTP, il farmaco era chiaramente inibitoria (Fig. 4). reazioni standard (Fig. 4. corsia 1), o reazioni normali addizionato con etanolo (Fig. 4. corsia 2), ha dato forti bande di RNA genoma nonché replicativi formano complessi intermedi e replicative. Campioni a cui erano stati aggiunti 20, 40, o 80 M dipiridamolo (Fig. 4. corsie 4, 5 e 6, rispettivamente), dato bande sequenzialmente deboli, indicando un'inibizione tossicodipendenti della sintesi dell'RNA virale. A 80 M dipiridamolo, mengovirus singolo filamento di RNA sintesi è stata inibita 96. La sintesi proteica in saggi cell-free. Krebs-2 lisati programmati con mengovirus RNA sono stati etichettati con 35 Smethionine come descritto in Materiali e Metodi. Le proteine ​​sono state frazionate mediante gel di poliacrilammide e rilevati mediante autoradiografia. Le reazioni non contenevano alcuna RNA (corsia 1) senza aggiunte (corsia 2) 80 M dipiridamolo (DPM, corsia 3) o 1,25 etanolo (EtOH, corsie 3 e 4). Le posizioni di migrazione delle proteine ​​mengovirus note sono indicati. sintesi di RNA in saggi cell-free. Krebs-2 lisati programmati con mengovirus RNA erano impulso marcato con 32 PCTP come descritto in Materiali e Metodi. Le reazioni non contenevano alcuna RNA (corsia 6) senza aggiunte (STD, corsia 1) 1,25 etanolo (corsie da 2 a 5) o 20, 40, o 80 M dipiridamolo (DPM) (corsie 3 a 5). I campioni sono stati frazionati su gel di agarosio 1 nativi, e le bande etichettati sono state visualizzate mediante autoradiografia. di STD è l'intensità relativa delle bande a singolo filamento genoma, come determinato da phosphorimaging e software ImageQuant. RI / RF, replicativa forma intermedia / replicativa. Il fatto che la traduzione replica RNA, ma non è stata influenzata da dipiridamolo in vitro era coerente con i risultati Replicon e saggi di riduzione della placca. Ma, se il dipiridamolo particolarmente colpite la sintesi di RNA, il passo mirato dovrebbe anche tenere conto di reversibilità di droga. Pertanto, Krebs-2 lisati programmati con RNA virione sono state incubate in presenza o assenza di dipiridamolo. Dopo 4 h, i complessi di replicazione sono stati raccolti per centrifugazione, risospese in lisati freschi (con o senza farmaco), e poi lasciati per sintetizzare RNA marcato per un'altra ora (Fig. 5). A meno che il dipiridamolo era presente durante entrambi i periodi di incubazione (Fig. 5. corsia 2), i campioni accumulati nuovo RNA virale per (circa) quantità equivalenti. Quando il dipiridamolo è stato rimosso dopo la prima incubazione, sintesi di RNA recuperato a livelli normali (Fig. 5. confronta corsie 1 e 3), confermando l'effetto in vitro sulla sintesi di RNA virale era effettivamente reversibile. Inoltre, anche quando dipiridamolo era presente durante il secondo periodo di incubazione, se l'incubazione precedente era stata farmaco libero (Fig. 5. corsia 4) sintesi di RNA è stato in grado di continuare. Questo modello suggerisce fortemente dipiridamolo mirato la formazione o l'attivazione di complessi di replicazione nuovi montati, ma non la progressione di complessi preformati. Dipiridamolo reversibilità in Krebs-2 test. Krebs-2 lisati programmati con mengovirus RNA virione sono state incubate per 4 ore a 32 ° C in presenza (corsie 2 e 3) o assenza (corsie 1 e 4) di 80 M dipiridamolo (DPM). I complessi di replicazione sono stati raccolti per centrifugazione a 16.000 g e poi risospese in lisati freschi in presenza (corsie 2 e 4) o assenza (corsie 1 e 3) di 80 M dipiridamolo. 32 PCTP stata aggiunta e l'incubazione è proseguita per 1 h. I campioni sono stati frazionati su gel di agarosio 1 nativi, e le bande etichettati sono state visualizzate mediante autoradiografia. Uridylylation di VPG e / o ai suoi precursori è uno degli eventi chiave richiesti presto replica RNA picornaviral (19. 20). Per determinare se dipiridamolo interferito con questo passo, abbiamo esaminato la sintesi di VPG-pupu in Krebs-2 lisati programmati con RNA virione in presenza e in assenza di farmaco (Fig. 6). Dopo 3,5 h di incubazione, reazioni standard erano pulse-etichettati con 32 putp per un'altra ora. complessi di replica, tra cui VPG-pupu, sono stati raccolti mediante centrifugazione, frazionato su gel, e analizzati per l'etichetta. Mentre uridylylated (etichetta) VPG è stato rilevato nella reazione standard (Fig. 6. corsia 2), poca o nessuna etichetta VPG era evidente in presenza di dipiridamolo (Fig. 6. corsia 3), o il campione mock-infettati (fig . 6. corsia 1). Questo esperimento è coerente con l'idea che il dipiridamolo di mira un primo passo nel ciclo di replicazione, ma non chiarisce se l'inibizione della uridylylation è la causa o la conseguenza di difetti tossicodipendenti globale più, come ad esempio il montaggio improprio o l'elaborazione di complessi di replica. Dipiridamolo e VPG uridylylation. Krebs-2 lisati programmati con: no RNA (corsia 1), vMwt RNA (corsia 2), o vMwt RNA più dipiridamolo (DPM) (80 M, corsia 3) sono stati pulse-etichettato con - 32 putp per 1 ora come descritto in Materiali e metodi. complessi di replica sono stati raccolti mediante centrifugazione, frazionato su gel Tris-Tricine e visualizzati tramite autoradiografia. La freccia indica la migrazione noto di VPG-Pupu. Krebs-2 test con l'RNA trascritto. Come discusso sopra, le estremità dei 5 trascrizioni poliovirus Replicon sono noti per influenzare l'efficienza complessiva e la tempistica di sintesi di RNA, dopo la trasfezione in cellule. L'extra non virali 5 basi hanno effetti ancora più forti sul poliovirus, più o meno selezione del modello-filamento nelle reazioni cell-free, dove fortuito riparazione di capi difettosi è meno probabile (12). J. Biol. Chem. Antimicrob. Agents Chemother. N. Engl. J. Med. Mol. Antimicrob. Agents Chemother. J. Biol. Chem. J. Biol. Chem. IV. Antimicrob. Agents Chemother.